การนับเชื้อแบบที่ 3

แบบ Membrane filtration method

วิธีนี้เหมาะสำหรับตัวอย่างมีจำนวนจุลินทรีย์อยู่น้อยและจำเป็นต้องใช้ปริมาตรของตัวอย่างมากเพื่อความแม่นยำในการตรจหาจุลินทรีย์แบบปริมาณวิเคราะห์ (quantitativeanalyses) ตัวอย่าง  100 มล.หรือมากกว่าจะถูกกรองผ่าน membrane filter  ซึ่งมีรูขนาด 0.45 ไมครอน (แบคทีเรียไม่สามารถผ่านได้) ดังนั้นจุลินทรีย์จะถูกกักอยู่บนกระดาษกรอง จากนั้นนำกระดาษกรองวางในจานอาหารที่มีกระดาษซึ่งชุ่มด้วยอาหารเหลว (liquid nutrient medium)อยู่แล้ว โคโลนีของจุลินทรีย์จะเจริญบนกระดาษกรอง วิธีนี้มักใช้กับการตรวจวิเคราะห์ coliform bacteria ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้ (indicator) การปนเปื้อนจากอุจจาระในอาหาร หรือน้ำ 

การนับเชื้อแบบที่ 2

แบบ Spread plate

 เป็นวิธีการนับจำนวนโคโลนีของจุลินทรีย์ที่เจริญบนอาหารเลี้ยงเชื้อโดยใช้เชื้อจุลินทรีย์ 0.1 มล.หยดลงบนจานอาหารที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อซึ่งแข็งตัวแล้ว (solidified agar medium)เชื้อจุลินทรีย์จะถูกแผ่กระจายทั่วผิวหน้าอาหารเลี้ยงเชื้อด้วยแท่งแก้วพิเศษที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว (spreader)วิธีนี้ผู้วิเคราะห์จะสามารถสังเกตลักษณะโคโลนีของจุลินทรีย์ได้ง่าย  ในบางครั้งวิธี spread plate อาจนับปริมาณเซลล์ได้มากกว่าวิธี pour plate  เนื่องจากจุลินทรีย์ไม่ได้เจอกับความร้อนจากอาหารเลี้ยงเชื้อหลอมเหลวเหมือนวิธี pour plate    ในกรณีที่ตัวอย่างมีเซลล์  จุลินทรีย์อยู่น้อย การใช้วิธีนี้อาจขาดความถูกต้องแม่นยำเนื่องจากใช้ปริมาณตัวอย่างค่อนข้างน้อย (0.1 มล.) ในการ plating

การนับเชื้อแบบที่ 1

การนับโดยตรง (direct count) เป็นการนับจำนวนโดยตรงจากกล้องจุลทรรศน์

 มี หลายวิธี  คือ

1.1 การนับเชื้อแบคทีเรียที่ผ่านการตรึงและย้อมสี (stained film) วิธีนี้เป็นการนับเชื้อแบคทีเรีย ปริมาตร 0.01 มล. ที่ถูกตรึงและย้อมสีอยู่บนสไลด์ภายในพื้นที่ 1 ตร.ซม. วิธีนี้มีข้อดีตรงที่ทำง่าย รวดเร็ว ค่าใช้จ่ายในการวิเคราะห์ไม่แพง แต่มีข้อเสียตรงที่เป็นการนับจำนวนแบคทีเรียทั้งหมด (total count) ทั้งเซลล์ที่มีชีวิตและไม่มีชีวิต นอกจากนี้ตัวอย่างที่จะตรวจนับต้องมีจำนวนเชื้อแบคทีเรียมาก

1.2 การนับเชื้อบนสไลด์ที่มี counting chamber  สไลด์ที่มี counting chamber ได้แก่

Petroff – Hausser counting chamber) นิยมใช้นับจำนวนแบคทีเรีย
Haemacytometer ใช้นับ eucaryotic microbe ที่มีขนาดใหญ่

สไลด์พวกนี้จะมีแอ่ง (chamber)ซึ่งรู้ความลึกของ chamberและที่พื้นของchamberจะมีตารางสี่เหลี่ยมซึ่งทราบความกว้างความยาวของตารางสี่เหลี่ยมดังนั้นเมื่อหยดเชื้อจุลินทรีย์ลงไปในchamberที่มีcoverglassปิดอยู่ตรวจนับเชื้อจุลินทรีย์ด้วยกล้องจุลทรรศน์กำลังขยาย 400Xในสี่เหลี่ยมลูกบาศก์เล็กก็จะทำให้สามารถคำนวณหาจำนวนเซลล์ต่องตัวอย่างได้สำหรับข้อดีข้อเสียของ countingchamber จะเหมือนกับนับด้วยวิธี stained film

วุ้น

       วุ้น เป็นสารประกอบ Hydrocolloids ได้จากการสกัดสาหร่ายแดง Gracilaria หน่วยย่อยพื้นฐานของวุ้นเป็นสารประกอบ Polysaccharide กลุ่ม Galactose  วุ้น (AGAR) มีคุณสมบัติในการอุ้มน้ำ ให้สารคงรูปที่มีลักษณะแข็ง ยืดหยุ่น ที่เรียกว่า Gel เมื่อ Gel ได้รับความร้อนที่อุณหภูมิสูงกว่า 85 องศาเซลเซียส ก็จะหลอมละลายอยู่ในรูปของเหลว แต่สามารถย้อนกลับมาอยู่ในรูป Gel อีกครั้ง เมื่ออุณหภูมิลงมาที่ 35-40 องศาเซลเซียส ซึ่งคุณสมบัติดังกล่าวทำให้ Agar เข้ามามีบทบาทสำคัญอย่างมากในอุตสาหกรรมด้านต่างๆ
          อุตสาหกรรมขนมหวาน ( Dessert Industry )  วุ้นนำมาใช้อย่างกว้างขวางในการทำขนมหวานหลายชนิด วุ้นมะพร้าวอ่อน วุ้นกะทิ วุ้นกาแฟ และเป็นตัวทำให้เกิด gel 
           อุตสาหกรรมอาหาร ( Food Industry )  ในผลิตภัณฑ์เนื้อ และสัตว์ปีก จะมีการใช้วุ้นเป็นวัตถุเจือปนอาหารเพื่อช่วยปรับปรุงคุณภาพของผลิตภัณฑ์ เช่น ช่วยให้มีลักษณะเนื้อสัมผัส ความสามารถในการอุ้มน้ำ สี และกลิ่นรสของผลิตภัณฑ์ดีขึ้น

Potato dextrose agar

        Potato dextrose agar ตัวย่อ PDA เป็นอาหารเลี้ยงเชื้อที่ประกอบด้วยมันฝรั่งและน้ำตาลเดกโทรส (dextrose) นิยมใช้สำหรับเลี้ยงเชื้อรา ยีสต์ และแบคทีเรีย เตรียมได้จากนำ มันฝรั่งมาหั่นเป็นชิ้นบางๆ 300 กรัม ต้มในน้ำ 30 นาที กรองแล้วจึงใส่ในอาหาร เติมเด็กโทรส และวุ้น (agar) อย่างละ 20 กรัม แล้วจึงนำไปนึ่งฆ่าเชื้อที่ความดัน 15 psi เป็นเวลา15 นาที การกรอกใส่ขวด นิยมใช้ขวดเหล้าแบนที่ล้างสะอาดและตากแห้งแล้วมากรอกอาหาร โดยใช้กรวยเล็กๆ กรอก ใส่อาหารลงไปให้สูงจากพื้นก้นขวดประมาณ ๑ นิ้ว ระมัดระวังไม่ให้อาหารเปื้อนปากขวด หากเปื้อนต้องใช้สะอาดเช็ดออกให้เกลี้ยงหรือถ่ายอาหารลงขวดใหม่      

 

ขั้นตอนการเตรียมวุ้น

1. นำมันฝรั่งมาล้าง ปอกเปลือก หั่นให้มีขนาด 1x1x1 เซนติเมตร
2. นำไปต้มกับน้ำสะอาด 1 ลิตร ต้มจนน้ำเดือด ใ้ช้ไฟอ่อน ๆ นาน 15 นาที
3. กรองเอากากมันออก เอาแต่น้ำวัดปริมาตรให้ได้ 1 ลิตร
4. ละลายวุ้นกับน้ำพอเปียก เทใส่ในน้ำต้มมันฝรั่ง นำไปต้มคนให้ละลายแล้วเติมน้ำตาลหรือกลูโคส คนละลายให้เข้ากัน แล้วยกลง
5. นำมาบรรจุขวดแบน ใส่อาหารวุ้นลงไปให้สูงจากพื้นก้นขวดประมาณ 1 นิ้ว ระวังไม่ให้วุ้นเปื้อนปากขวด อุดด้วยสำลีและหุ้มด้วยกระดาษ รัดยางให้แน่น
6. นำขวดวุ้นไปนึ่งในหม้อนึ่งความดัน ใช้ความดันประมาณ 15-16 ปอนด์/ตารางนิ้ว นึ่งนานประมาณ 25-35 นาที
7. เมื่อขวดอาหารวุ้นยังอุ่นพอจับได้ ให้นำขวดไปเอียงเพิ่มพื้นที่ผิววุ้น (การเอียงขวดให้หาไม้มารองด้านปากขวด หรือคอขวด)
8. เมื่อขวดวุ้นเย็นนำไปเขี่ยเนื้อเยื่อเห็ดใส่ หรือถ้ายังไม่เขี่ยเชื้อให้นำขวดอาหารวุ้นไปเก็บไว้ในตู้เย็นก่อนเพื่อรอเขี่ยเชื้อ สามารถเก็บขวดอาหารวุ้นได้นานเป็นเดือน

 

อุปกรณ์ที่ใช้ในการทดลอง

1. อบเชย                             
2. ดอกกระเจี๊ยบตากแเห้ง    
3. กานพลูตากแห้ง                
4. ผงวุ้น
5. น้ำตาลทราย
6. น้ำกลั่น
7. เพลตทดลอง
8. เตาแก๊สปิกนิค
9. แท่งแก้วคนสาร
10. หม้อ
11. ทัพพี
12. น้ำเปล่า
13. ครก
14. ขวดรูปชมพู่
15. เชื้อรา Aspergillus niger
16. มีด
17. มันฝรั่ง